
藥物分析
Pharmaceutical Analysis
藥物分析
蛋白質(zhì)、多肽藥物表征分析
- 分類(lèi):蛋白質(zhì)、多肽藥物表征分析
- 發(fā)布時(shí)間:2020-04-28 00:00:00
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基于先進(jìn)的質(zhì)譜和色譜平臺(tái),華大蛋白提供了如下生物藥表征分析服務(wù):
1)精確分子量測(cè)定
2)一級(jí)序列確證
序列覆蓋度/肽譜分析
N端及C端序列確證
3)修飾譜分析
4)糖基化修飾分析
糖基化位點(diǎn)及糖型分析
寡糖譜分析
5)二硫鍵分析
6)ADC藥物偶聯(lián)位點(diǎn)分析
7)電荷異質(zhì)性分析
8)聚體和片段含量分析
9)唾液酸含量分析
10)宿主殘留蛋白鑒定及定量
11)氨基酸含量分析
12)藥物靶點(diǎn)確認(rèn)
生物藥表征分析的必要性:
確保生物藥的穩(wěn)定性、藥效、藥代動(dòng)力學(xué)、用藥安全性
詳細(xì)內(nèi)容:
1)精確分子量測(cè)定
采用高精度質(zhì)譜可獲得生物藥的精確分子量,質(zhì)量誤差可在 1Da 之內(nèi)。根據(jù)這一基本質(zhì)量 屬性,一方面可以判斷生物藥一級(jí)序列結(jié)構(gòu)的正確性,另一方面可以獲得生物藥分子上可能存 在的主要修飾形式。
2)一級(jí)序列確證
序列覆蓋度/肽譜分析
肽譜分析是對(duì)生物藥品一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行確證的金標(biāo)準(zhǔn)。涉及的檢測(cè)方式有兩種,一種是使用質(zhì)譜 (MS) 鑒定序列,一種是使用紫外(UV)檢測(cè)比較樣品譜圖與參比譜圖的一致性。
N端及C端序列確證
抗體或重組蛋白由于N末端信號(hào)肽序列加工不完全,易發(fā)生末端甲硫氨酸殘基變異、焦谷氨酸環(huán)化修飾等。C末端則常見(jiàn)序列截短,如單克隆抗體重鏈C末端Lys殘基缺失。因此,需對(duì)產(chǎn)品的末端氨基酸序列進(jìn)行分析,以鑒別蛋白質(zhì)的氨基端、羧基端的性質(zhì)及其均一性。
3)修飾譜分析
翻譯后修飾是各類(lèi)重組蛋白、抗體中普遍存在的現(xiàn)象,會(huì)帶來(lái)產(chǎn)品的異質(zhì)性并影響質(zhì)量。ICH-Q6B指南要求應(yīng)對(duì)生物藥的脫酰胺、磷酸化、糖基化、氧化等修飾形式進(jìn)行分析,制定驗(yàn)收質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。高精度質(zhì)譜結(jié)合專(zhuān)業(yè)的解析軟件,可對(duì)蛋白質(zhì)上存在的翻譯后修飾種類(lèi)及其占比進(jìn)行分析。
4)糖基化修飾分析
同其他修飾不同,糖基化修飾具有極高的異質(zhì)性,是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)異質(zhì)性的重要因素。糖鏈的結(jié)構(gòu)在補(bǔ)體激活和受體親和性上發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,因而,糖基化修飾又是影響治療性抗體有效性的關(guān)鍵屬性。此外,非人類(lèi)來(lái)源的糖型可能會(huì)引發(fā)免疫反應(yīng),而帶來(lái)安全性問(wèn)題。因此,糖基化修飾分析是表征治療性糖蛋白(尤其是單抗)的重要部分。ICH-Q6B指南提出,需對(duì)糖蛋白的糖基化位點(diǎn)、糖鏈結(jié)構(gòu)(糖型)及含量進(jìn)行明確。
糖基化修飾較為復(fù)雜,對(duì)分析技術(shù)的要求較高,只有具備有效的富集手段、高精度LC-MS/MS及專(zhuān)業(yè)的數(shù)據(jù)解析軟件,方能對(duì)糖基化進(jìn)行有效的表征。
糖基化位點(diǎn)及糖型分析
在藥物篩選階段,可以通過(guò)糖肽分析,同時(shí)獲得糖基化修飾位點(diǎn)、糖鏈類(lèi)型及各糖型的相對(duì)豐度信息,簡(jiǎn)便快捷,流程如下:
糖蛋白酶解 ®糖肽富集®LC-MS/MS分析®數(shù)據(jù)解析
寡糖譜分析
一般采用pNGaseF酶將糖鏈從糖蛋白上酶解下來(lái),并將糖鏈用2-AB試劑進(jìn)行衍生化標(biāo)記,之后一方面采用高精度質(zhì)譜對(duì)糖鏈類(lèi)型進(jìn)行鑒定,另一方面可通過(guò)熒光信號(hào)對(duì)糖鏈進(jìn)行定量分析。在放行階段,可僅采用熒光色譜對(duì)糖譜進(jìn)行定量分析。
5)二硫鍵分析
二硫鍵分析可用于生物藥的結(jié)構(gòu)分析,協(xié)助完成分子設(shè)計(jì)、性質(zhì)改良和工藝研究。非還原條件下的肽譜數(shù)據(jù),結(jié)合專(zhuān)業(yè)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)解析,可獲得二硫鍵定位信息。
6)ADC藥物偶聯(lián)位點(diǎn)分析
對(duì)于A(yíng)DC藥物而言,對(duì)藥物在抗體上的偶聯(lián)位點(diǎn)及其偶聯(lián)比例進(jìn)行表征是進(jìn)行質(zhì)量控制的關(guān)鍵步驟。通過(guò)高精度質(zhì)譜技術(shù)可同時(shí)獲得偶聯(lián)位點(diǎn)及其比例,并可根據(jù)比例計(jì)算DAR值。
7)電荷異質(zhì)性分析
蛋白質(zhì)所帶有的翻譯后修飾會(huì)引起表面電荷改變,產(chǎn)生電荷異質(zhì)性,進(jìn)而影響藥物的親和力等。通過(guò)等電聚焦凝膠電泳(IEF)、毛細(xì)管等電聚焦凝膠電泳(cIEF)、陽(yáng)離子交換色譜法(CEX)和陰離子交換色譜法(AEX)可以對(duì)抗體主峰和酸(堿)性變異體進(jìn)行分析。
8)聚體和片段含量分析
蛋白質(zhì)構(gòu)象波動(dòng)或局部結(jié)構(gòu)微變可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)中具有聚集傾向的序列或“熱點(diǎn)(hot spot)”暴露,進(jìn)而形成二聚體和/或寡聚體。在生物藥開(kāi)發(fā)過(guò)程中以及在整個(gè)生產(chǎn)中均應(yīng)對(duì)電荷異構(gòu)體進(jìn)行鑒定和監(jiān)測(cè)。利用分子排阻色譜法(SEC-HPLC)可對(duì)單體和多聚體分子進(jìn)行分離及含量分析。
9)唾液酸含量分析
唾液酸對(duì)于維持糖蛋白的穩(wěn)定性和空間構(gòu)象具有重要作用,抗體藥物的N-聚糖和O-聚糖上的唾液酸主要為N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)和N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Gc),因人體不能合成 Neu5Gc,故其具有一定的免疫原性。為確保藥物的安全和效用,保持批次間質(zhì)控的一致性,ICH Q6B規(guī)定了在工藝開(kāi)發(fā)、制造純化、劑型開(kāi)發(fā)和穩(wěn)定性測(cè)試等過(guò)程中需監(jiān)測(cè)唾液酸結(jié)構(gòu)與相對(duì)含量。檢測(cè)時(shí)首先對(duì)蛋白質(zhì)上的唾液酸酸解,之后利用三重四極桿質(zhì)譜LC-MS/MS(QTRAP4500)檢測(cè),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)唾液酸含量進(jìn)行準(zhǔn)確定量。
10)宿主殘留蛋白鑒定及定量
美國(guó)藥典已經(jīng)明確,需采用LC-MS/MS技術(shù)對(duì)生物藥宿主殘留蛋白進(jìn)行鑒定及定量,建立這類(lèi)雜質(zhì)控制的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。不同批次原液及產(chǎn)品均應(yīng)進(jìn)行宿主殘留蛋白的分析。由于宿主殘留蛋白含量低,其分析受到藥物主成分的影響,因此如何對(duì)其進(jìn)行較為全面的鑒定和定量,需要在技術(shù)方法上進(jìn)行考量。
11)氨基酸含量分析
將蛋白質(zhì)或多肽酸水解后進(jìn)行衍生化及HPLC分析。
12)藥物靶點(diǎn)確認(rèn)
蛋白質(zhì)芯片是進(jìn)行藥物靶點(diǎn)分析的有力工具。運(yùn)用獨(dú)一無(wú)二的人兩萬(wàn)點(diǎn)蛋白質(zhì)芯片與目標(biāo)藥物孵育,之后用熒光標(biāo)記的特異抗體、親和素等方式進(jìn)行顯色,即可對(duì)藥物的作用靶點(diǎn)進(jìn)行確認(rèn)。
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